Optogenetic Stimulation and Voltage Imaging of Cultured Neurons

Abstract

Hjärnan och nervsystemet är uppbyggda av nervceller som har kontakt och pratar med varandra genom långa utskott. Kommunikationen sker med elektriska signaler. Varje nervcell har specifika elektriska egenskaper som påverkar hur den fungerar. Att studera enstaka nervceller och deras elektriska egenskaper har länge begränsats av att gängse mätmetoder varit tidskrävande och svåra att bemästra. Patch clamp-mätningar har varit den gyllene standarden sedan början av 80-talet. Med den metoden öppnas en cell under stor försiktighet med hjälp av en liten pipett innehållandes en elektrod. Elektroden används sedan för att göra elektriska mätningar i cellen och kan även injicera ström. Med optogenetik använder man ljusproteiner (små ljuskänsliga enheter i cellen) från mikroorganismer som kan översätta ljussignaler till elektriska signaler och vice versa. Man har sedan millennieskiftet stoppat in dessa i nervceller och därmed kunnat stimulera cellerna genom att lysa på dem. Förhoppningen har länge funnits att man med hjälp av dessa ljusproteiner och optiska mätmetoder även ska kunna avbilda cellernas elektriska aktivitet. Stora framsteg har gjorts de senaste åren och de optiska metoderna börjar få ordentligt fotfäste inom neurofysiologin. Verktyget "Optopatch" tillåter användaren att både optiskt stimulera och avbilda nervceller, efter att de modifierats till att uttrycka särskilda ljusproteiner. För att detta ska ske i vår forskargrupp behöver metoden testas och utvärderas noggrant för att belysa dess möjligheter och begränsningar. Med heloptiska metoder öppnas nya dörrar för storskalig karaktärisering på cellulär nivå av sjukdomar drabbande nervsystemet. Optopatch-konstruktet innehåller två modifierade ljusproteiner som tillåter mätningar. Ett så kallat ”kanalrodopsin” vid namn CheRiff fungerar som ett ställdon. Det är en ljuskänslig kanal i cellens membran som vid belysning med blått ljus aktiveras och då öppnar sig för positiva joner (elektriskt laddade partiklar) att flöda in i cellen. Detta är en positiv elektrisk ström som ”aktiverar” cellen. Det andra ljusproteinet—QuasAr—fungerar som en spänningssensor och självlyser (fluorescerar) i rött när cellen aktiveras. Genom att fånga upp fluorescensen med en höghastighetskamera kopplad till mikroskopet kan elektrisk aktivitet fångas på bild och nervcellerna kan därmed både stimuleras och avbildas med optiska metoder. Detta möjliggör storskaliga undersökningar av enstaka nervceller. Målet med projektet var att få metoden att fungera. Optopatch kunde uttryckas i nervceller som odlats i laboratorium och båda komponenternas (CheRiffs och QuasArs) funktioner bevisades med hjälp av patch clamp-mätningar. Ljusproteinerna verkade vara synnerligen stabila. Kvarstår gör ytterligare testning och utökade experiment för att i forskargruppen kunna utnyttja Optopatch för robusta och storskaliga mätningar i framtida studier.